Jay D. Keasling開發基於Cas9工具蛋白質體外進化方法

生物極客2018-08-02 07:45:42

Keasling課題組描述了一種穩健的方法。該方法採用易錯PCR和Cas9,介導突變的基因整合到單個或多個基因組位點,效率達到98-99%。為了驗證該方法對代謝基因產物的定向進化的適用性,我們在的甲羥戊酸途徑中設計了兩種必需的酶,其中所選擇的變體支持高出11倍的類異戊二烯產生。通過促進同源基因組環境中數百個核苷酸的有效誘變而擴展到現有的CRISPR技術。

作為原理驗證,在酵母釀酒酵母中應用該方法以設計編碼香葉基香葉基二磷酸合酶和600bp區域的非必需基因的300bp催化結構域。 編碼HMG-CoA還原酶的非必需基因。

最後,目前,大多數基於CRISPR / Cas9的定向進化方法依賴於相對較小(80-120bp)DNA片段的整合並且可能需要耗時構建變體文庫和/或多樣化的基於陣列的寡核苷酸的相對昂貴的DNA合成。使用CasPER,現在可以在整個供體片段長度範圍內以非常高的效率證明較大基因組位點的多重基因組工程,從而可以實現任何複雜的多基因性狀的成本效益,高通量和穩健的進化研究。 通過同源重組支持異源DNA基因組整合的生物體。



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