獻給初學者:實時熒光定量 PCR(realtime PCR)

生物學霸學霸君2018-01-12 16:02:46



所謂實時熒光定量 PCR 技術,是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個 PCR 進程,最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。



 

樣品 RNA 的抽提步驟


  1. 取凍存已裂解的細胞,室溫放置 5 分鐘使其完全溶解。


  2. 兩相分離 每 1 ml 的 TRIZOL 試劑裂解的樣品中加入 0.2 ml 的氯仿,蓋緊管蓋。手動劇烈振盪管體 15 秒後,15 到 30 ℃ 孵育 2 到 3 分鐘。4 ℃ 下 12 000 rpm 離心 15 分鐘。


    離心後混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相,中間層以及無色水相上層。RNA 全部被分配於水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的 TRIZOL 試劑的 60%。


  3. RNA 沉澱 將水相上層轉移到一干淨無 RNA 酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉澱其中的 RNA,混勻後 15 到 30℃ 孵育 10 分鐘後,於 4℃ 下 12 000 rpm 離心 10 分鐘。此時離心前不可見的 RNA 沉澱將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。


  4. RNA 清洗 移去上清液,每 1 mlTRIZOL 試劑裂解的樣品中加入至少 1 ml 的 75% 乙醇(75% 乙醇用 DEPCH2O 配製),清洗 RNA 沉澱。混勻後,4℃ 下 7 000 rpm 離心 5 分鐘。


  5. RNA 乾燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使 RNA 沉澱在室溫空氣中乾燥 5~10 分鐘。


  6. 溶解 RNA 沉澱 溶解 RNA 時,先加入無 RNA 酶的水 40μl 用槍反覆吹打幾次,使其完全溶解,獲得的 RNA 溶液保存於 -80 ℃ 待用。




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